Brambory - zdravá potravina

Metodika fúze protoplastů elektrickým polem

Součást výstupu V002 v rámci projektu NAZV QF4108
„Využití techniky fúze protoplastů ve šlechtění hospodářsky významných plodin rodu Brassica, Cucumis a Solanum
uplatněné a ověřené při řešení MSM 6010980701
„Molekulární a technologické základy produkce kvalitních brambor“

Autorský kolektiv:
Ing. Marie Greplová
Mgr. Hana Polzerová
Ing. Jaroslava Domkářová, Ph.D., MBA

1. Úvod

Efektivní tvorba nových odrůd s požadovanými znaky vyžaduje kombinaci tradičních šlechtitelských postupů s moderními technologiemi, jako jsou kultury in vitro, zahrnující produkci dihaploidních linií, fúze protoplastů a využití transformace při vytváření geneticky modifikovaných organismů. Moderní rostlinné biotechnologie se stávají nezbytnou součástí šlechtění rostlin na rezistenci vůči biotickým a abiotickým stresům a přispívají tak k rozšíření odrůdového spektra a ke snížení nákladů na chemické ochranné prostředky. Rezistentní šlechtění (sexuální hybridizace) hospodářsky významných plodin vůči chorobám a abiotickým činitelům často naráží na řadu komplikací jako je sexuální inkompatibilita rodičovských genotypů, nevhodný poměr EBN (Endosperm Balance Number, Carputo a kol. 1997) nebo malá úspěšnost tradiční sexuální hybridizace. Problémy s přenosem rezistence v klasických postupech vedly k výzkumu možnosti netradičních postupů jak u modelových rostlin, tak i u dalších druhů. Alternativní způsob přenosu genů nabízí mezidruhové nebo mezirodové fúze protoplastů (Millam a kol. 1995). Protože neexistují bariéry ve fúzi protoplastů, až dosud inkompatibilní a tedy reprodukčně izolované druhy mohou být kombinovány na úrovni protoplastů. Heterokaryony vzniklé fúzí obsahující jádro dvou druhů ve společné cytoplazmě, regenerují novou buněčnou stěnu, zahajují dělení, při kterém dochází k jaderné fúzi a vzniku somatické hybridní buňky. Somatická hybridní buňka je totipotentní a tedy schopná embryogeneze nebo organogeneze a vývoje v celistvou rostlinu. Materiálem vhodným pro získávání protoplastů jsou kultury in vitro, kde odpadá problematická povrchová sterilizace. Z rostlinných orgánů jsou obecně vhodné a použitelné různé části rostliny, obvykle to jsou buňky listového mezofylu, mladých hypokotylů, popřípadě kalusů. Somatická hybridizace poskytuje nejenom metodu k produkci hybridů mezi sexuálně inkompatibilními druhy, ale i cestu pro genetickou modifikaci vegetativně množených plodin, sterilních nebo částečně fertilních druhů a jedinců s přirozeně dlouhým životním cyklem. Protoplastové fúze a regenerace také umožňují mezidruhový a vnitrodruhový přenos extranukleárních genetických elementů jako je mitochondriální DNA (cytoplasmová samčí sterilita), chloroplasty a cytoplasma. Aplikace somatické fúze vyžaduje nejen regeneraci rostlin z protoplastů, ale i úspěšnou integraci získaných regenerantů do šlechtitelského programu. Somatický hybrid by měl být schopen zpětného křížení s kulturní plodinou k vývoji nové variety. Metoda somatické hybridizace byla již ve světě úspěšně aplikována u celé řady kulturních rostlin včetně rodu Solanum a byl potvrzen přenos rezistence nebo nových kvalitativních znaků (Butenko a kol. 1982, Austin a kol. 1985, Pehu a kol. 1989, Pehu a kol.1990, Schilde-Rentschler a kol. 1993, Thieme a kol. 1997, Helgeson a Haberlach 1999).

V rámci řešení projektu byla propracována metodika izolace protoplastů, fúze protoplastů elektrickým polem a kultivace produktů fúze.

2. Metodický postup

Předkládaný metodický postup fúze protoplastů elektrickým polem vyžaduje dostatek vhodného rostlinného materiálu pro izolaci protoplastů a po vlastní elektrofúzi jejich kultivaci k dosažení regenerace rostlin. Vlastní metodika má tedy čtyři nedílné části.

  • Kultivace donorových rostlin
  • Izolace protoplastů
  • Ověření životnosti protoplastů a fúze protoplastů elektrickým polem
  • Kultivace produktů fúze

2.1 Kultivace donorových rostlin

In vitro rostliny pěstujeme v klimatizační komoře s fotoperiodou 16 h/8 h světlo/tma (světelné podmínky: zářivky, typ světla – „daylight“, intenzita - 60 µmol m-2 s-1), při 22 °C. Rostliny kultivujeme na MS mediu bez hormonů (Murashige a Skoog 1962).

Obr. 1 Rostliny rodu Solanum kultivované in vitro pro izolaci protoplastů
Obr. 1 Rostliny rodu Solanum kultivované
in vitro
pro izolaci protoplastů

Rostliny určené pro izolaci protoplastů množíme na SH médiu bez hormonů (Schenk a Hildebrand 1972) obohaceném o AgNO3 a Alar 85 (succinic acid dimethylhydrazide) - 10 až 20 rostlin od každého rodičovského genotypu. Rostliny necháme růst po dobu 4 - 6 týdnů (Obr. 1 Rostliny rodu Solanum kultivované in vitro pro izolaci protoplastů). Den před izolací vystavíme rostliny chladu (10 °C) a tmě po dobu 24 hodin. Tyto stresové podmínky umožní synchronizaci buněčného cyklu, což se pozitivně odrazí v následné regeneraci protoplastů.

2.2 Izolace protoplastů

Celý proces izolace protoplastů probíhá ve sterilním prostředí.

Odtrhneme listy (z 10 rostlin, 0,5 - 1 g), rozřežeme je na malé kousky ostrým skalpelem v jedné Petriho misce (Ø = 5 cm) obsahující 5 - 6 ml roztoku enzymu (Bříza a Machová 1991) a utěsníme Petriho misku Parafilmem.

Petriho misky inkubujeme ve tmě přes noc (14 – 16 h) v termostatu při 25 oC; po uplynutí této doby zhodnotíme stav rostlinné tkáně pod mikroskopem; v některých případech (v závislosti na genotypu) umístíme Petriho misky na třepačku asi na15 min.

Rostlinnou tkáň s enzymatickým roztokem přeneseme pomocí jednorázové pipety s otevřeným koncem na sítko (velikost pórů 75 µm) umístěné na Petriho misce (Ø = 5 cm) a za jemného míchání propláchneme sítko sterilním roztokem 0,5 M sacharózy. Tímto krokem oddělíme uvolněné protoplasty od zbytku rostlinné tkáně. Takto získanou suspenzi protoplastů rozdělíme do centrifugačních zkumavek (8 ml) a převrstvíme roztokem W5 (Menczel a kol. 1981) o objemu 1 ml.

Centrifugujeme 12 min při 700 rpm.

Obr. 2 Nepoškozené protoplasty na rozhraní roztoku sacharózy a W5
Obr. 2 Nepoškozené protoplasty
na rozhraní roztoku sacharózy a W5

Pasteurovou pipetou opatrně odsajeme plující protoplasty tvořící prstýnek (Obr. 2 Nepoškozené protoplasty na rozhraní roztoku sacharózy a W5) na rozhraní použitých roztoků a umístíme je do nové centrifugační zkumavky, přidáme potřebné množství W5 (5 ml) a resuspendujeme.

Centrifugujeme 6 min při 500 rpm.

Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant, přidáme W5 (2 – 5 ml) a resuspendujeme pelet.

Centrifugujeme 6 min při 500 rpm a Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant.

Přidáme kultivační médium SW11 (Bříza a Machová 1991), aby bylo dosaženo požadované hustoty 6×105/ml (viz 2.3.2) nebo pokračujeme dle protokolu fúze protoplastů elektrickým polem.

2.3 Ověření životnosti, úprava hustoty a fúze protoplastů elektrickým polem

2.3.1 Vyhodnocení životnosti protoplastů před fúzí

20 µl ředěného FDA + 20 µl suspense protoplastů pipetujeme na podložní sklo, vytvoříme preparát. Po 4 - 5 minutách vyhodnotíme preparát pomocí fluorescenčního mikroskopu. Ve vybraném zorném poli bez UV světla spočteme protoplasty a následně zeleně svítící protoplasty v UV světle (zeleně svítící protoplasty jsou živé). Vypočteme procentní podíl životných protoplastů z celkového počtu protoplastů v zorném poli. Při životnosti nad 50 % je zkoumaná suspenze použitelná pro fúze.

2.3.2 Určení hustoty protoplastů pomocí Bürkerovy komůrky

Úprava koncentrace protoplastů před fúzí (před kultivací) probíhá ve sterilním prostředí.

K naizolovaným protoplastům přidáme Pasteurovou pipetou přiměřené množství (2 – 4 ml) předfúzního roztoku (Schilde-Renschler a Ninneman 1988), resuspendujeme (v tomto roztoku mohou protoplasty pobývat až 2 hodiny v lednici při 6 – 7 oC) a určíme hustotu protoplastů pomocí Bürkerovy komůrky.

Zhotovíme preparát, počítáme protoplasty v pěti 3× orámovaných čtvercích (tj. čtverce o straně 1 mm), vlevo a nahoře počítáme všechny buňky dotýkající se střední linky, vpravo a dole tyto nepočítáme. Stanovíme průměrný počet protoplastů z pěti čtverců, což odpovídá hodnotě „X“. Koncentrace buněk v 1 ml pak je: „X“ × 104 (1 čtverec reprezentuje objem 0,1 mm3 tj. 10-4 cm3 [1 cm3 = 1 ml]).

Celkový počet protoplastů z hmoty listů = Vsuspenze × „X“ × 104

Faktor ředění Fř = požadovaná hustota / „X“ × 104

Výsledný objem suspense v požadované hustotě = Vsuspenze / Fř

Následně podle potřeby upravíme koncentraci pro fúze (viz 2.3.3) nebo kultivace protoplastů.

2.3.3 Úprava koncentrace protoplastů před fúzí a fúze protoplastů

Centrifugujeme 3 min při 500 rpm a Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant. Celý proces fúze protoplastů probíhá ve sterilním prostředí.

Pasteurovou pipetou přidáme fúzní roztok (Schilde-Renschler a Ninneman 1988), aby byla dosažena požadovaná koncentrace protoplastů pro fúzi 6×105/ml a protoplasty resuspendujeme.

Smícháme suspenze protoplastů dvou fúzních partnerů v poměru 1:1.

Obr. 3 Příklad uspořádání fúzního experimentu
Obr. 3 Příklad uspořádání fúzního experimentu

Fúze protoplastů je uskutečněna pomocí elektroporátoru (ECM 2001, BTX, Inc., San Diego, CA) a příslušenství (mikroskop, držák na fúzní komůrky, fúzní komůrky, Obr. 3 Příklad uspořádání fúzního experimentu). Mikroskop umístíme do flowboxu, před fúzí vysterilizujeme komůrky 70% alkoholem a necháme vyschnout. Po vyschnutí naneseme Pasteurovou pipetou 20 - 30 µl suspenze protoplastů do elekroporační komůrky, umístíme do držáku, celý proces fúze sledujeme v invertním mikroskopu.

Obr. 4 Příklad fúze protoplastů - vlevo aplikace AC pole, vpravo aplikace DC pulsu
Obr. 4 Příklad fúze protoplastů - vlevo aplikace AC pole, vpravo aplikace DC pulsu

Proces fúze protoplastů: protoplasty se nechají seřadit za působení střídavého proudu (AC field), poté je aplikován puls stejnosměrného proudu (DC pulse), který vede k fúzi (Obr. 4 Příklad fúze protoplastů - vlevo aplikace AC pole, vpravo aplikace DC pulsu).

  • Základní parametry elektrického pole
    AC 5 V/komora se vzdáleností elektrod 0,5 mm 2 – 18s
    DC puls 10 V/ komora se vzdáleností elektrod 0,5 mm 80 µs
    AC 30 V/komora se vzdáleností elektrod 3,2 mm 2 – 18s
    DC puls 60 V/komora se vzdáleností elektrod 3,2 mm 80 µs

Po fúzi umístíme protoplasty z pěti komůrek Pasteurovou pipetou do jedné Petriho misky (Ø = 3,5 cm), k suspenzi protoplastů přidáme 1 ml kultivačního média (tekuté SW11, Bříza a Machová 1991). Petriho misky zatěsníme Parafilmem, přemístíme je do termostatu a kultivujeme ve tmě při 25 oC. Další kultivace dle protokolu kultivace produktů fúze protoplastů.

2.4 Kultivace produktů fúze protoplastů

Celý proces kultivace produktů fúze probíhá ve sterilním prostředí.

Obr. 5 Regenerace produktů fúze: a, b - mikrokalusy v tekutém médiu SW11, c - kalusy v tekutém médiu Shepard D, d – kalusy na médiu Shepard D zpevněném agarem, e - regenerace prýtů na kalusech před seříznutím
Obr. 5 Regenerace produktů fúze;
a, b - mikrokalusy v tekutém médiu SW11
c - kalusy v tekutém médiu Shepard D,
d – kalusy na médiu Shepard D zpevněném agarem,
e - regenerace prýtů na kalusech před seříznutím

První buněčné dělení se obvykle uskuteční 2 – 3 dny po fúzi (ověříme pod mikroskopem), po vytvoření buněčné stěny přidáváme v intervalu 7 – 10 dní tekuté médium SW11 se snižující se hladinou osmotika až do stádia mikrokalusů (tj. postupně SW11 0,5M manitol, SW11 0,4 M manitol, SW11 0,3M manitol, Bříza a Machová 1991; Obr. 5 Regenerace produktů fúze; a, b - mikrokalusy v tekutém médiu SW11). Po vytvoření buněčné stěny možno kultivovat na světle (16 h fotoperioda/ 22 oC; světelné podmínky: fluorescenční zářivky – „daylight“, 150 µmol m-2 s-1).

Mikrokalusy se formují 3 – 4 týdny po fúzi, jsou-li již viditelné - provádí se výměna média. Médium SW11 odsajeme a nahradíme tekutým médiem Shepard C (Shepard a Totten 1977). Po 7 – 10 dnech výměnu 2x opakujeme.

Následně sterilně přeneseme kalusy do čistých Petriho misek. Část kalusů kultivujeme v tekutém médiu Shepard D (Shepard a Totten 1977), výměnu média provádíme po 7 – 10 dnech až do regenerace stonků. Část kalusů kultivujeme na agarem zpevněném médiu Shepard D, na kterém se kalusy pasážují po 14 dnech až do regenerace stonků (Obr. 5 Regenerace produktů fúze; c - kalusy v tekutém médiu Shepard D, d – kalusy na médiu Shepard D zpevněném agarem).

První stonky se vyvíjejí 4 – 12 týdnů po zahájení kultivace na médiu Shepard D (Obr. 5 Regenerace produktů fúze; e - regenerace prýtů na kalusech před seříznutím), regenerované prýty seřízneme a necháme zakořenit na MS médiu (Murashige a Skoog 1962). Regeneranty kultivujeme za stejných podmínek jako donorové rostliny pro izolaci protoplastů. Rostliny množíme do dvojic k následnému testování hybridity.

3 Použité roztoky a média – jejich příprava

3.1

  • Murashige & Skoog médium
    MS (Duchefa Biochemie) 4,4 g
    sacharóza 30 g
    agar 8 g
    MS a sacharózu rozpustíme v 490 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a doplníme na objem 500 ml destilovanou vodou. Agar rozpustíme v 400 ml destilované vody a rozvaříme v mikrovlnné troubě nebo ve vodní lázni, doplníme na konečný objem (500 ml). Oba roztoky spojíme a promícháme a rozlejeme do kultivačních nádob (do výšky 1 – 2 cm) a zavíčkujeme. Nádoby s médiem sterilizujeme autoklávováním při 121 oC 20 min.
     
  • Schenk & Hildebrand médium
    SH médium (Duchefa Biochemie) 3,2 g
    Vitamíny SH (Duchefa Biochemie) 1,01 g
    sacharóza 15 g
    AgNO3 0,003 g
    Alar 0,0015 g
    Agar 8 g
    Kromě agaru vše rozpustíme v 490 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a doplníme na objem 500 ml destilovanou vodou. Agar rozpustíme v 400 ml destilované vody a rozvaříme v mikrovlnné troubě nebo ve vodní lázni, doplníme na konečný objem (500 ml). Oba roztoky spojíme a promícháme a rozlejeme do kultivačních nádob (do výšky 1 – 2 cm) a zavíčkujeme. Nádoby s médiem sterilizujeme autoklávováním při 114 oC 20 min.

3.2

  • Enzymatický roztok
    Zásobní roztok:
    CaCl2.2 H2O 0,735 g
    MES 1,952 g
    Sacharóza 171,15 g
    NAA 0,005 g (zásobní roztok 100 mg/100 ml, sterilizace filtrací)
    ZT 0,002 g (zásobní roztok 50 mg/100 ml, sterilizace filtrací)

    Navážku bez růstových regulátorů rozpustíme v 480 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8. Zásobní roztok sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min. Po sterilizaci přidáme růstové regulátory a doplníme sterilní destilovanou vodou na 500 ml. Rozdělíme po 50 ml do uzavíratelných nádob. Roztok je možné zamrazit na – 20 oC. (ZT = zeatin; NAA = alpha-naphthylenacetic acid; MES = 2 – (N- morpholino)ethanesulfonic acid).

    Příprava enzymů:

    Celuláza Onozuka R-10 (Duchefa Biochemie) 1 g (respektive 1 U)
    Macerozym R-10 (Duchefa Biochemie) 0,2 g (respektive 0.2 U)

    Navážku rozpustíme, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a doplníme do 50 ml destilovanou vodou a sterilizujeme filtrací. Případně navážku přepočteme podle „U“ jednotek uvedených na etiketě konkrétního balení enzymu.

    Pracovní roztok enzymů:

    50 ml enzymů smícháme ve sterilních podmínkách s 50 ml zásobního roztoku (případný přebytek pro uchování zamrazíme na – 20 oC až na 1 měsíc).

  • 0,5 M sacharóza
    Sacharóza 171,15 g

    rozpustíme v destilované vodě na konečný objem 1000 ml, sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min, uchováváme v chladu při 6 – 7 oC.
     

  • Roztok W5
    NaCl 9,0 g
    KCl 0,8 g
    CaCl2.2 H2O 18,4 g
    Glukóza 1,0 g
    Glycin 1,0 g

    rozpustíme v 990 ml destilované vody, upravíme pH na 5,8 a doplníme destilovanou vodou na 1000 ml. Sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min, uchováváme v chladu při 6 – 7 oC.

3.3

  • Roztok FDA (fluoresceindiacetát)
    FDA 0,005 g

    Zásobní roztok připravíme rozpuštěním navážky v 1 ml acetonu. Pracovní roztok: 20 µl zásobního roztoku přidáme do 1 ml kultivačního roztoku, sacharózy nebo W5.
     

  • Předfúzní roztok
    Manitol 7,4 g
    CaCl2. 2H2O 0,011 g

    rozpustíme v 90 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 a doplníme destilovanou vodou na 100 ml. Sterilizujeme autoklávováním při 121 oC 20 min.
     

  • Fúzní roztok
    Manitol 7,4 g

    rozpustíme v 90 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 a doplníme destilovanou vodou na 100 ml. Sterilizujeme autoklávováním při 121 oC 20 min.

3.4

  • Médium SW11
    SW11

    SW11

    SW11 (0,4M)

    SW11 ( 0,3M)

    SW11 ( 0,2M)

     

     

     

     

     
    KNO3

    950 mg

     

     

     
    CaCl2.2 H2O

    367,5 mg

     

     

     
    MgSO4. 2 H2O

    185 mg

     

     

     
    KH2PO4

    85 mg

     

     

     
    NH4Cl

    133 mg

     

     

     
    Myo-inositol

    100 mg

     

     

     
    Casein hydrolysate

    500 mg

     

     

     
    L-glutamin

    100 mg

     

     

     
    Yeast extract

    100 mg

     

     

     
    Sacharóza (0,01M)

    3423 mg

     

     

     
    manitol

    89,2682 g

    72,87 g

    54,65 g

    36,44 g

     

     

     

     

     
    Thiamine. HCl

    10 mg

    připravíme zásobní roztoky (100 ml)
    Pyridoxine. HCl

    1 mg

    o koncentraci 1 mg/1 ml  
    Nicotinic acid

    1 mg

     

     

     
    H3BO3

    3 mg

    (a do média pipetujeme příslušné množství,
    MnSO4. 4H2O

    14 mg

    např. Thiamine. HCl 10 ml)
    ZnSO4. 7H2O

    2 mg

     

     

     
    CuSO4.5H2O

    0,025 mg

     

     

     
    KI

    0,75 mg

     

     

     
    Na2MoO4. 2H2O

    0,25 mg

     

     

     
    CoCl2. 6H2O

    0,025 mg

     

     

     
    FeSO4. 7H2O

    13,9 mg

     

     

     
    Na2EDTA.2H2O Chelaton III

    37,3 mg

     

     

     
     

     

     

     

     
    NAA

    2 mg*

     

     

     
    2,4 D

    0,2 mg

     

     

     
    Zeatin

    0,5 mg*

     

     

     

    rozpustíme v 950 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min. Sterilně přidáme Zeatin a NAA a doplníme sterilizovanou destilovanou vodou na 1000 ml, uchováváme v chladu při 6 – 7 oC.

    * Zeatin - zásobní roztok 50 mg/ 100ml sterilizujeme filtrací. NAA - zásobní roztok 100 mg/100 ml sterilizujeme filtrací.
     

  • Médium Shepard C a Shepard D
     

    C0,3M

    C0,2M

    D0,2M

     

    NH4 NO3

     

     

    1650 mg

     

    KNO3

    1900 mg

     

    1900 mg

     

    CaCl2.2 H2O

    440 mg

     

    440 mg

     

    MgSO4. 7 H2O

    370 mg

     

    370 mg

     

    KH2PO4

    170 mg

     

    170 mg

     

    Na2EDTA

    37,3 mg

     

    37,3 mg

     

    FeSO4. 7H2O

    27,8 mg

     

    27,8 mg

     

    H3BO3

    6,2 mg

     

    6,2 mg

    připravíme zásobní roztoky (100 ml)
    MnCl2. 4H2O

    19,8 mg

     

    19,8 mg

    o koncentraci 1 mg/1 ml
    ZnSO4. 7H2O

    9,2 mg

     

    9,2 mg

     
    KI

    0,83 mg

     

    0,83 mg

    (a do média pipetujeme příslušné množství,
    Na2MoO4. 2H2O

    0,25 mg

     

    0,25 mg

    např. H3BO3 6,2 ml)
    CuSO4. 5H2O

    0,025 mg

     

    0,025 mg

     

    CoSO4.7H2O

    0,03 mg

     

    0,03 mg

     

    Myo-inositol

    100 mg

     

    100 mg

     

    Thiamin. HCl

    0,5 mg

     

    0,5 mg

     

    Glycin

    2 mg

     

    2 mg

     

    Nicotinic acid

    5 mg

     

    5 mg

     

    Pyridoxine. HCl

    0,5 mg

     

    0,5 mg

     

    Folic acid

    0,5 mg

     

    0,5 mg

     

    Biotin

    0,05 mg

     

    0,05 mg

     

    Casein hydrolyzate

    1000 mg

     

    1000 mg

     

    Adenin sulfát

    40 mg

     

    40 mg

     

    NAA

    0,05 mg*

     

     

     
    IAA

     

     

    0,1 mg*

     

    BAP (6-benzylaminopurin)

    0,5 mg*

     

     

     
    Zeatin

     

     

    0,5 mg*

     

    Manitol

    54,654 g

    36,44 g

    36,44 g

     

    Sacharóza 15 mM

    5,1345 g

     

    5,1345 g

     

    MES

    0,976 g

     

    0,976 g

     

    Agar (zpevněné médium)

     

     

     7 g

     

    rozpustíme v 950 ml destilované vody, upravíme pH na 5,8 a sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min. Sterilně přidáme NAA, IAA, zeatin, BAP popř. kyselinu giberelovou (viz výše) a doplníme sterilizovanou destilovanou vodou na 1000 ml, uchováváme v chladu. Shepard D připravujeme buď tekuté médium nebo s agarem, agarem zpevněné médium rozléváme do Petriho misek ve flow-boxu.

    * Zeatin - zásobní roztok 50 mg/100 ml sterilizujeme filtrací. NAA - zásobní roztok 100 mg/100 ml sterilizujeme filtrací. BAP – zásobní roztok 50 mg/100 ml sterilizujeme filtrací.

3.5 Kontrola sterility použitých roztoků

Všechny roztoky před každým použitím zkontrolujeme bakteriálním testem: 1 ml roztoku + 1 ml provokačního média. Kultivujeme ve tmě při 25 oC po 3 – 4 dnech hodnotíme (přítomnost infekce je indikována mléčným zabarvením roztoku).

Provokační médium: Standard I nutrient broth for microbiology (Merck) – 25 g/l

4 Hodnocení regenerantů

Hybridnost regenerantů je třeba ověřit. Pro hodnocení hybridnosti je vhodné použít k určení ploidie průtokovou cytometrii jako preselekční metodu (http://lmcc.ieb.cz/book/flow-cytometry). Potenciální somatické hybridy je třeba ověřit některou z metod DNA analýzy např. RAPD (Greplová a kol. 2007).

5 Literatura

  • Austin S, Baer MA, Helgeson JP (1985) Transfer of resistance to potato leaf roll virus from Solanum brevidens into solanum tuberosum by somatic fusion. Plant Sci 39: 75-82
  • Bříza J, Machová I (1991) Regeneration of plants from leaf mesophyll protoplasts of the tetraploid potato cultivars Xenia and Bintje. Biologia plantarum 33 (3): 225-233
  • Butenko R, Kuchko A, Komarnitsky I (1982) Some features of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. chacoense and its F1 sexual progeny. In: A. Fujiwara (Ed.), Plant tissue culture. Proc 5th Int Congr Plant Tiss Cell Cult, Tokyo: 643-644
  • Carputo D, Barone A, Cardi T, Sebastano A, Frusciante L, Peloquin SJ (1997) Endosperm balance number manipulation for direct in vivo germplasm introgression to potato from a sexually isolated relative (Solanum commersonii Dun.). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94 (22): 12013-12017
  • Helgeson JP, Haberlach GT (1999) Somatic hybrids of Solanum tuberosum and related specie. In: Plant biotechnology and in vitro biology in the 21st century (Eds Altman A, Ziv M, Izhar S) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht: 151-154
  • Greplová M, Polzerová H, Kreuz L (2007) Protoplast fusion by electric field at the model material S. tuberosum L. Scientific studies 15 – Potato Research Institute Havlíčkův Brod, 2007: 71-83
  • Menczel L, Nagy F, Kiss ZR, Maliga P (1981) Streptomycin resistant and sensitive somatic hybrids of Nicotiana tabacum + Nicotiana knightiana: correlation of resistance to N. tabacum plastids. Theor Appl Genet 59: 191-195
  • Millam S, Payne LA, Mackay GR (1995) The integration of protoplast fusion-derived material into a potato breeding programme – a review of progress and problems. Euphytica 85: 451-455
  • Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497
  • Pehu E, Karp A, Moore K Steele S, Dunckley R, Jones MG K (1989) Molecular, cytogenetic and morphological characterization of somatic hybrids of dihaploid Solanum tuberosum and diploid S. brevidens. Theor Appl Genet 78: 696-704
  • Pehu E, Gibson RW, Jones MG K, Karp A (1990) Studies on the genetic basis of resistance to Potato Leaf Roll Virus, Potato Virus Y and Potato Virus X in Solanum brevidens using somatic hybrids of Solanum brevidens and Solanum tuberosum. Plant Sci 69: 95-101
  • Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50: 199-204
  • Shepard FJ, Totten RE (1977) Messophyll cell protoplasts of potato. Plant Physiol 60: 313-316
  • Simko I (2002) Comparative analysis of quantitative trait loci for foliage resistance to Phytophthora infestans in tuber-bearing Solanum species. Amer J Potato Res 79: 125-132
  • Schilde-Renschler L, Ninnemann H (1988) Kombination von Kartoffellinien durch Protoplastenfusion zur Regeneration tetraploider züchterisch nutzbarer Hybidpflanzen. Vortr Pflanzenzüchtg 14: 149-163
  • Schilde-Rentschler L, Ruoss B, Schierbaum B, Ninnemann H (1993) Availability of new genetic resources from wild species for potato breeding. Abstracts 12 th triennal EAPR conference Paris: 99-100
  • Thieme R, Darsow U, Gavrilenko T, Dorokhov D, Tiemann H (1997) Production of somatic hybrids between S. tuberosum L. and late blight resistant Mexican wild potato species. Euphytica 97: 189-200

Poděkování

Autoři děkují recenzentovi Doc. Ing. Josefu Habětínkovi, CSc. za prostudování rukopisu a cenné připomínky.

© 2017 VÚB Havlíčkův Brod | Přihlásit | Mapa stránek
Web: Crespo | Design: Jiří Trachtulec